112015
 

 

 

由于浸矿功能基因破解困难,冶金微生物与浸矿功能相关的代谢途径长期以来不甚清晰。本项目研究了公布的冶金微生物全基因组序列,发现总结了浸矿相关基因、蛋白的特异性特征,建立了基于生物信息学和分子生物学的浸矿功能基因识别方法,以生物冶金模式菌嗜酸氧化亚铁硫杆菌为研究对象,通过全基因组生物信息学分析,结合基因表达差异研究,从全基因组序列中识别出230个浸矿功能关键基因,并对其中32个关键基因进行了序列分析、蛋白结构预测、分子对接、克隆、蛋白表达纯化、表征以及酶活性测定等功能研究。

研究了关键硫代谢蛋白反向异二硫化物还原酶HdrC亚基的结构与功能,通过紫外光谱、电子顺磁共振谱分析、定点突变实验和结构模拟等手段研究发现该蛋白缺失一个铁硫簇,从而导致反向异二硫化物还原酶行使反向功能,催化硫中间产物GSnH (n>1) 中的硫烷硫转变为亚硫酸反应,在生物浸矿硫分步氧化中发挥关键作用。

研究了冶金微生物与电子传递链相关的细胞色素c4蛋白结构与功能。A. ferrooxidans菌有4个细胞色素c4蛋白,通过结构预测发现Cyc1的63位点的酪氨酸和121位点的谷氨酸附近的空间结构差异决定这4个细胞色素c4蛋白的功能差异,从而解释Cyc1和Cyc2分别在在铁氧化的下山电子传递链和上山电子传递链中发挥作用,CycA1和CycA2在硫氧化电子传递链中都发挥作用。

研究了关键铁代谢蛋白亚铁氧化酶Iro的结构与功能,通过结构预测发现它属于4个半胱氨酸配位[Fe4S4]铁硫簇的高电位铁硫蛋白(HiPIP)家族蛋白,对离铁硫簇十分近的Tyr10虚拟突变实验预测了该位置处的芳香环对保护铁硫簇起重大作用,蛋白质的表达纯化及定点突变实验进一步证实了这些结论。

研究了关键热激蛋白GroEL的结构与功能,分析了中度嗜热冶金微生物耐热机理。确定了GroEL蛋白在50℃左右时活性最高,且其活性具有温度依赖性。发现GroEL在较高的温度条件下,能够协助更多的其他蛋白的正确折叠维持其生理生化功能,从而揭示了中度高温浸矿环境下冶金微生物仍然较好地生存,并发挥浸矿功能原因。

此外,研究了其他电子传递链相关(正向和反向细胞色素bc1复合体、铁氧还蛋白、4个终端氧化酶aa3、ba3、bo3和bd复合体等)、亚铁氧化相关(蓝铜蛋白Rus、反向细胞色素bc1复合体、铁分子伴侣蛋白CyaY等)、硫氧化相关(硫化物泛醌还原酶SQR、亚硫酸氧化酶、高电位铁硫蛋白HiPIP、亚硫酸还原酶SiR、腺嘌呤-5’-磷酸硫酸酶APS、巯基二硫键作用G蛋白DsbG、谷胱甘肽还原酶等)、二氧化碳固定相关(核糖-5-磷酸异构酶)、抗性相关(砷抗性蛋白ArsH、铜抗性蛋白)以及其他关键蛋白(乙酰辅酶A脱氢酶MCAD、铁硫簇合成蛋白)等共32个关键蛋白结构和功能,这些工作为揭示生物浸矿分子机理提供了一定理论基础。

综合关键功能基因鉴定结果和各方面研究成果,完善和构建了冶金微生物浸矿功能相关的代谢途径模型,包括矿物的分解,溶液中的反应,微生物的呼吸链、亚铁氧化、硫代谢、碳固定、氮固定及生物膜形成等部分。另外发现嗜酸氧化亚铁硫杆菌的浸矿系统中,很多关键酶基因呈现多拷贝性现象,如C型细胞色素c552有4个,bc1复合体有2套,终端氧化酶有4套,硫氧化SQR有3个,硫氧化TQO有2套,固碳的RuBP有4套等,这些情况包含在浸矿代谢途径模型中,它从分子水平上解释了冶金微生物适应浸矿极端环境和利用多种能源的机制。

上述工作首次系统地在基因、蛋白质等分子层面描述了微生物分解矿物利用其铁、硫能源,固定碳、氮源实现生长,并产生胞外多聚物黏附矿物的浸矿过程,为冶金微生物浸矿机理的阐明提供了一定的分子理论基础。

上述研究成果分别发表于Archives of Biochemistry and Biophysics, 2007, 463: 237-244;World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2011, 27: 2981-2988;Protein Expression and Purification, 2007, 52: 146-152;Journal of Basic Microbiology, 2010, 50: 591-598;Current Microbiology, 2008, 57: 274-280;Current microbiology, 2009, 58: 586-592;Current microbiology, 2011, 62: 733-738;Current microbiology, 2012, 65: 416-423;Current Microbiology, 2013, 66: 88-95;Biotechnology Letters, 2007, 29: 1983-1990;Biotechnology Letters, 2008, 30: 905-910;Biotechnology Letters, 2007, 29: 1965-1972;Transactions of Nonferrous Metals Society of China, 2008, 18: 995-1002;Journal of Central South University of Technology, 2007, 14: 612-617和嗜酸氧化亚铁硫杆菌浸矿过程铁硫代谢体系的研究, 博士学位论文, 中南大学, 2008。

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